激光荧光显微镜用滤光膜

由于其高亮度、稳定性、长寿命和窄光谱带宽,激光在荧光成像应用中正逐渐取代传统的宽带光源。在成像应用中,激光的上述特性可以提高可视化的灵敏度并增加光通量;激光还具有光束发散角窄、时间和空间相干性高、偏振清晰等独特特性,这激发了许多新的荧光成像技术。然而,与宽带光源相比,当激光器以荧光源的形式出现时,对基于激光的成像系统及其组件提出了新的要求和限制,尤其是对滤光膜。


针对激光源优化的滤光膜


在过去的四十年里,已经开发出了许多强大、高效和成本效益高的激光器。人们通常根据增益介质和激发模式对激光器进行分类。到目前为止,用于荧光成像的最流行的激光器是静止气体激光器(如氩离子和氪离子激光器),最常用的激光谱线是488、568和647nm。然而,近年来,由于固态激光器的更高效率(更低的发热量、更简单的实验室安装)和更低的成本,固态激光器正在逐渐取代气体激光器。流行的激光器类型包括半导体二极管激光器(尤其是405和635 nm)、光泵浦半导体激光器(包括广泛使用的488 nm)和倍频二极管泵浦固态(DPSS)激光器(包括561 nm黄色激光器和更新的515 nm和594 nm激光器)。


滤光膜在激光荧光显微镜中的应用


由于分束器直接暴露于强激发光,即使来自滤光片的微弱自发荧光也会干扰发射光的信号。因此,应使用超低荧光基质,如熔融石英。请注意,由于激发光和发射信号之间的强度差异,发射滤光片对自身荧光的要求不会像对颜色分离器那样严格。然而,在显微镜中,发射滤光片的强度明显高于典型的荧光广角显微镜滤光片的强度,因为系统中的激光束将从样品载体玻璃完全反射并沿着发射路径重定向。因此,与宽带系统中的自发荧光相比,应该仔细考虑该激光系统中发射滤光片的自发荧光。


在一些应用中,分束器将对图像质量产生显著影响,尤其是当分光器的平面度(曲率)不合适时。即使通过波前误差矩阵曲率的影响不明显,反射波前误差也会对成像质量产生显著影响。例如,当具有低平坦度的分束器被放置在激发路径中时,显微镜中的样品照明可能会变弱。类似地,由于硬涂层的固有弯曲应力,它可能导致从彩色分离器反射的成像光束的图像偏移。因此,一些应用应该使用具有高平面度的分光器。对于大多数激光显微镜,分束器应该足够平坦,以便照射的激光束的焦点不会发生显著偏移,其中焦点偏移通常由瑞利范围定义。简单地说,分光器反射的成像光束的合格标准是,在分光器上反射后,衍射斑的大小不应发生显著变化。


基于激光的显微镜成像系统的结构复杂且昂贵。在从中获得最高性能的过程中,滤光膜的作用非常重要。正确选择使用与其性能相匹配的滤光膜更为重要。基于激光的成像系统的未来是什么?为了更好地观察细胞或亚细胞结构之间的相互作用机制,出现了许多复杂的成像方案。高效的滤光膜在这些前沿应用中发挥着越来越重要的作用。

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